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T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA 5'-磷酸末端和3'-羟基末端间的连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口，以上反应均需消耗ATP。

随酶附带10×T4 DNA Ligation Buffer及独特配方的2×Quick Ligation Buffer提供给您更多的选择：而使用10×T4 DNA Ligation Buffer，16℃过夜连接可获得最高的连接效率；使用快连Buffer在室温(25℃)下，仅需5分钟即可完成粘性末端或平滑末端DNA片段的连接反应。

• DNA片段和载体DNA的连接。
  
• DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。

在20μL的连接反应体系中，6μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个单位。

组分	规格
T4 DNA连接酶(350U/μL)	80μL
2×Quick Ligation Buffer	1mL
10×T4 DNA Ligation Buffer	1mL

保存：-20℃


1×反应缓冲液，16℃温育。


65℃加热10分钟。


经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带，PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。

• 粘性末端的连接反应：插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2～6:1之间最好，低了会导致较低的连接效率，高了则会导致多个片段插入。摩尔比请按载体与插入片段DNA浓度及分子大小来计算。
  
• 平末端的连接反应：平末端的连接反应与粘性末端相比反应较慢(其Km值约为粘性末端的100倍)。进行平末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到粘性末端量的2～5倍左右。
  
• 向粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果(0.05～0.1μg/μl以上)。
  
• 反应温度：该酶的最适温度为37℃，由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16℃下进行。若反应1～2小时左右的话也可在室温下进行反应。
  
• 抑制剂：T4 DNA连接酶要求Mg²⁺，因此螯合Mg²⁺的EDTA的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。

图1．在25℃，用不同活性单位（2U、4U、6U）T4 DNA连接酶与λDNA/Hind III片段作用10分钟后的结果以及连接产物灭活T4连接酶后再次使用Hind III酶切结果。
泳道1：λDNA/Hind III；
泳道2：λDNA/Hind III+2U T4 Ligase；
泳道3：λDNA/Hind III+4U T4 Ligase；
泳道4：λDNA/Hind III+6U T4 Ligase；
泳道5：λDNA/Hind III,T4 Ligase连接产物，Hind III酶切


快速连接步骤：

• 取50ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用双蒸水调整总体积为10μL。
  
• 加入10μL 2×Quick Ligation Buffer，混匀。
  
• 加入0.5～1μL T4 DNA连接酶，充分但轻柔混匀（切勿剧烈震荡，易导致酶部分失活）。
  
• 瞬时离心，置于室温(25℃)作用5分钟。
  
• 冰上放置，转化（如不立即进行转化实验，请冻存于-20℃）

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